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发表于: 2015-5-5 15:33:59 | 显示全部楼层 |阅读模式

杂交中稲生育后期剑叶早衰及调控

熊达有原江西第三制药厂

摘要：杂交中稲生育后期剑叶早衰是受高温强光逆境胁迫加速了叶片的光氧化进程。叶片过早衰老削弱了叶片的光合量，减少了灌浆物质的来源，影响水稻产量和大米的外观质量。本研究采用化学诱导法唤醒植物本身具有的防御自然灾害的基因，通过分子遗传学手段延缓植物叶片衰老。

（一）前言

衰老是指生理成熟后，导致植株. 器官. 组织或细胞走向死亡的过程，这是一个受遗传调控的程序化过程。杂交中稲生育后期受高温强光逆境胁迫而产生的跃变型的衰老过程，它不是自然衰老的根本原因，只是一种器官水平上的程序化死亡过程，因此剑叶早衰是可防控。

著名植物生理学家娄成后院士在一次学术报告指出：植物与环境之间的相互作用，遗传基因在功能上表达，放大与变异，修饰；基因的破损，关闭与消失，以及多基因间的协调效应，顺序运行，大多数是在环境变化的启动下或干扰下才实现的，善于运用逆境与顺境的机遇，把激素的化学物质，施到作物上是调节作物生长发育，改善作物的抗逆性是最有效的手段（1）。一种化学物质只能诱导一个基因表达，两种或两种以上的植物生长调节物质与一些生理活性物质混合使用，有可能多个有益的基因表达，从而呈现增效，加合或互补的应用效果（2）。随着全球气候变暖，水稻的高温危害正日益引起世界的广泛关注，这给水稻生产和粮食安全造成很大的冲击。国内外专家学者开展了广泛的理论研究，但涉及如何采用化学物质调控基因表达发表的成果不多。水稻在漫长的进化过程中已具备防御自然灾害的基因，只不过是水稻的这种基因经过长时间的选育和过度的保护性栽培使得这种功能逐渐处于休眠；钝化；甚至丧失。本研究是利用化学诱导法去唤醒处于休眠状态的基因重新表达，通过分子遗传学手段延缓叶片的衰老（3）。

根据化学诱导调控理论指导，笔者研发了“6BA+GA3+PCPA”复合制剂，通过多年的田间试验，结果表明该配方所产生的群体效应及基因间的协调效应：源叶寿命延长；光合作用效应增强；籽粒库容扩大；光合产物装卸速度加快。

本技术符合发明专利的新颖性，创造性，实用性，国家知识产权已受理（201410405890）

（二）叶片早衰产生的原因

以光能激活而产生的光化学反应，除了光合作用外，还有光氧化反应，光氧化反应在日常生活中司空见惯，有些化学药品（Vc、VE、SA等）见光变色说明这些化学药品已发生光氧化反应，为避免发生光氧化反应，常采用棕色瓶包装，液体药剂中常加入少量的抗氧化剂。抗氧化剂就是还原剂，通过还原剂首先被氧化而保护药剂本身的延缓氧化的作用，确保药剂在安全期内有效成分符合质量标准。C3植物（小麦，水稻等）在富氧环境里光氧化现象经常发生，水稻叶片的光合速度在一定的温度范围内随光照强度的增加而提高。上世纪八十年代有人发现植物叶片在强光照射下，其光合速度反而下降的现象，人们称这现象叫光抑制（或叫光保护）。这可能是植物在逆境环境中，诱抗素（ABA）在细胞间传递信息与保卫细胞的钾离子相应位点接合，通过一系信号转导最终完成部分气孔关闭，进行“午休”。气孔是植物代谢的门户，气孔关闭直接影响CO2的同化及水汽蒸腾的速度。我们都知道光合作用是由光反应与碳反应所组成，它们之间相互依存，相互制约。CO2是碳反应的原料，随着CO2吸收的减少，碳反应速度减慢，导致光能转换的障碍；热量累积及过剩电子滞留在植物体内。大家都知道，化学反应的发生必须要有一定的能量激发，滞留在体内的热量愈高被激活的氧分子愈多，处于激活状态下的氧分子与过剩的电子结合而生成活性氧即自由基（O2），O2的氧化能力强，水稻叶片的光氧化伤害是由活性氧引发的（4）。有金属离子存在下能加速光氧化的进程，原因是金属离子能催化活性氧发生Haber—weis反应生成活性更强的羟基自由基（.OH）它能氧化所有的细胞成分，直接引起膜脂的过氧化，叶绿素的“漂白”。

O2+e 02

H2O2+O2 OH+OH+O2

H2O2+O2+2H H2O2+O2

H2O2 H2O+O2

（三）细胞分裂素（CTK）延缓叶片衰老机理探讨

早在1957年Richmond&Lang用离体苍耳叶片浸泡在激动素的溶液里，发现该叶片在较长时间里仍保持绿色，人们对这一发现抱有很高的期望，经过大量的研究，CTK延缓叶片衰老得到肯定，我国在文革期间（1975）上海农科院和沈阳化工研究院合作开发6BA的田间试验；20ppm6BA水溶液喷施生长势不同的植株上，发现6BA能延缓叶片的衰老；叶绿素含量比对照增加10%-40%，灌浆速度加快，千粒重比对照高0.2克-2.0克，结实率提高2%-4%，增产3.1%-19.1%，其中长势差的增幅较大。而不同品种CTK（激动素，玉米素.6BA）以6BA的效果最明显（5）。关于CTK延缓叶片衰老的机理，众说纷纭。

叶片衰老的特征是叶片黄化，叶绿素，蛋白质，脂肪，核酸的降解。叶绿体是叶片蛋白的主要贮存器官（70%-80%）有人证实，从衰老叶片中输出的氮，90%是来自叶绿体，蛋白质的降解的起始阶段可能是在完整的叶绿体内进行。

有人认为6BA延缓叶片衰老的作用机理可能是延缓叶片蛋白质的降解（6）。潘瑞炽教授（1993）认为：6BA能加强叶绿素的生物合成过程，同时可使小麦叶片光合磷酸化活性增强，进一步研究证实小麦叶片叶绿体中存在6BA专一结合的蛋白质。ABA与6BA有拮抗效应，可能是6BA改变了结合蛋白的某些性质（7）。

Gross&Leshem(1978)报导，CTK能降解叶片衰老组织中脂氧合酶活性，而Leshem(1979)认为CTK可能作为自由基的淬火剂，因为CTK分子结构中氨基键上的H可以脱去产生酰胺，从而降低了膜脂的过氧化作用，保持膜的完整性。比较一致看法是CTK可以改善叶片活性氧代谢，降低了活性氧对细胞组织的伤害，这一点已得到肯定。外用CTK延缓叶片衰老的确切机理尚不清楚，有可能是影响了内源CTK水平，补偿旗叶后期CTK的不足，同时又促进了根系合成和CTK的运输能力，可能是延缓衰老的重要原因。

还有一些人认为叶片的衰老与叶片气孔开启度有关；日本的仓石晋用一个简单的小实验说明叶片气孔的作用，他用凡士林将气孔封闭，发现CTK不能延缓叶片的衰老，持上述观点的当时还有美国的蒂曼。他们认为CTK能促进气孔开放，从而促进了处理区的水汽蒸腾散热的作用，消除体内积累的热量，阻止活性氧的产生。

自从Mccod（1969）和Fridorich(1975.1978)发现细胞内存在超氧歧化酶（SOD）后关于生物体内的自由基反应以及由此引发的脂质的过氧化问题，引起人们的关注。自由基衰老学说已成为最活跃的研究领域。SOD是植物氧化代谢最主要的抗氧化酶，SOD的功能就是清除生物体内的自由基，其作用机理就是通过发生歧化反应生成无毒的氧气和毒性较低的过氧化氢，而过氧化氢再被CAT或POD分解成水和氧气，最大限度限制氧自由基和过氧化氢发生反应生成羟基自由基的能力。较多的人认为CTK对叶片延缓衰老的作用与对细胞的SOD的调控作用有关。段留生等研究结果表明（10）：6BA提高了衰老后期旗叶中SOD和POD的活性，降低了自由基的含量，改善了活性氧代谢，延缓了旗叶衰老，表现在叶绿素和膜脂的过氧化程度。对此有人提出异议这不是CTK延缓叶片衰老的原发作用，仍有待进一步完善。

笔者认为，细胞分裂素延缓叶片衰老的机理可能与CTK分子结构中—NH2有一定关系，这种假设是根据分子结构中游离—NH2与蛋白质，氨基酸核酸有较大的亲和力，从而形成一种保护层，抑制了蛋白质降解。一般认为，PSⅡ的D1蛋白是活性氧伤害的主要靶器官，6BA分子结构中—NH2与D1蛋白的结合，保护了活性氧对D1蛋白的伤害。维护高效率D1蛋白的周转是保护光合机构的关键，这种理论假设可以用以下事例证明：

(1) 多胺是分子结构中有多个—NH2的化合物的总称，黄维玉的研究结果指出：以腐胺，亚精胺，精胺溶液渗入小麦离体叶片，在黑暗条件下，对照叶绿素有所下降，而三胺处理的叶片有明显的保绿效果：精胺（4胺）﹥亚精胺（3胺）﹥腐胺（2胺）增绿效果随NH2数目增多而效果明显增强，研究者认为多胺能缓叶片衰老与清除自由基的功能有关，多胺都具有刺激作物生长，抗衰老与调控核酸，蛋白质的合成作用有关（8）。

(2)甲壳胺分子结构中的游离—NH2对各种蛋白质的亲和力较强，可用来作酶，抗原；抗原体等生理活性物质的固定化载体，使酶细胞保持高度的活力，进一步研究结果表明：甲壳胺分子结构中—NH2略带正电荷与略带负电荷的脂肪，核酸蛋白质能相聚结合，6BA分子结构中的氨基与叶片内蛋白质形成一个保护层从而延缓了蛋白质的降解。

(3)6BA分子结构中—NH2同样对各种蛋白质，氨基酸具有较强的亲和力，这一点从法国的Mother X光片自显影的方法上很容易观察到放射性处理过氨基酸向6BA处理的部位聚集。李玲（1989）“细胞分裂素结合蛋白的研究进展”一文指出：细胞内存在一种结合蛋白，结合蛋白就是受体，6BA分子结构中的游离—NH2与受体蛋白质的特异结合，在细胞间的传导，从而引起一系列的生理效应。潘瑞炽教授用电子显微镜放射自显影方法，发现6BA既可和质膜，液泡膜及线粒体膜相结合，又可和细胞核特别是核仁相结合，说明6BA的受体呈现多位点结合现象（7）。后来人们又在拟南芥中发现AHK4才是CTK真正的受体蛋白，细胞分裂素同AHK4细胞外区域直接结合，并激活其在细胞内的组氨酸酶活性从而将激素信号跨膜传递。

(4)细胞分裂素信号传导途径的研究是阐明细胞分裂素作用分子机理的关键。从分子水平阐明植物激素受体功能以及植物激素对植物基因的表达的调控机制.进而通过植物基因的手段.将农业生产以更高的水平迅猛发展（11）。

（四）自由基清除的新论点

随着科学研究深入发展，清除自由基成功的事例越来越多，将这些成功事例串联起来，综合分析你会惊人发现：氧自由基的清除与广义的氧化还原反应原理是一致的。自由基即游离基，是生物代谢过程中产生的未配对电子原子，自由基活性强，在一般条件下不能稳定单独存在，有人比喻自由基是“单身汉”，容易自行结合或掠夺其他化合物的电子，细胞膜系统是自由基攻击的靶器官，外源适当水平的抗氧化剂与生物体内的O2进行电子传递的氧化还原反应，一种物质得到电子，另一种物质失去电子，得失电子数目相等，O2是氧化剂得到电子变成无毒害的氧分子，原来的氧自由基的氧化能力顿时灰飞烟灭；上述的理论假设可以从下面科研成果得到验证：

1 花卉在储运过程中，切花叶片易变黄，标志看叶片内蛋白质，核酸，叶绿素的降解，在储运前采用苯甲酸或培酸丙脂，一定浓度处理叶片，能阻止叶片变黄；苯甲酸或核酸丙酯都是食品加工中应用的抗氧化剂，也是最早应用在植物上作保鲜剂。其抗氧化作用机理就是清除自由基，延长切花的寿命。

2 VE（生育酚）广泛存在绿色植物中，VE化学药品在空气中慢慢氧化，有亚铁离子存在时氧化速度加快。2mmol浓度VE处理离体小麦叶片，可减缓叶绿素和蛋白质的降解，SOD活性没有下降。MDA累积减少（9）。

3 VC（抗坏血酸）广泛存在于水果，蔬菜里的一种维生素，在植物体内参与电子传递系统中的氧化还原作用，促进植物新陈代谢。VC有自由基清除的功能，是较强的还原剂，见空气易氧化变色。

4 SA（水杨酸）是植物体内含有的天然苯酚类；植物生长调节剂，也是一种具有生理活性化合物，见光变色。SA能提高作物的抗逆能力，增加叶绿素含量，减少叶片的蒸腾，提高SOD活性，汪小峰(1998)报导,用SA处理小麦叶片，能提高叶片的叶绿素和蛋白质含量，抑制活性氧的增加。保护膜的完整性，在小麦灌浆期间，喷1—2次乙酰水杨酸，可延长叶片的光合作用，提高结实率10%—12%。其他苯酚类化合物，如对苯二砏，邻苯二砏，间苯二砏都具有抗氧化功能。

5亚硫酸（HSO3）是还原剂，在氧化还原反应中能提供电子，早期的田间试验中用0.05%浓度喷施水稻叶片，能促使叶片由黄转绿色，增加光合作用，提高水稻产量；用2m moL浓度HSO3处理小麦叶片，促进叶片内SOD酶的含量2.5%；在大豆品种试验结果（中国科学院植物所提供）：大豆叶片的光合强度提高15.6%，抑制光呼吸强度32.2%，对叶绿素希尔效应活性提高28.9%，增产效果可达15%左右。其他不饱和如亚硝酸HNO2草酸都具有清除O2的功能，其作用机理就是提供电子使氧自由基生成O2从而清除自由基对叶绿素蛋白质的过氧化作用，保持膜的完整性。

(五) 结果与讨论

延缓叶片衰老有多种途径：一是通过调控叶片气孔开放度，加强蒸腾消除体内的热量累积；减少活性氧产生的活化能；

二是活性氧产生后也可通过抗氧化剂的使用，以广义的氧化还原反应的电子传递而消除O2；

三是采用保护活性氧伤害的靶器官PSII的D1蛋白，维持高效率D1蛋白的周转运行，从而保护光合机构的正常运转，都能达到延缓叶片衰老的基本要求。而如何调控环境因素来最大限度增加光合强度，提高光合效率是本技术综合解决方案。苏宝林“水稻栽培技术”一书指出：水稻高产技术的实质就是合理调整叶片（包括调整叶片积大小，叶片的长相）提高叶片的光合物质的生产能力。

（1）（6BA+GA3+PCPA）复合制剂使用方法及应用效果

在水稻抽穗10%左右，用本药剂100ml，稀释400倍，每亩喷施40升；叶片喷施处理，应用效果如下：

(A) 提高水稻的抗逆性能，延缓剑叶早衰，光合功能期延长。

GA3的抗逆性能虽然没有6BA强，但6BA+GA3能产生协同效应，抗逆性能进一步加强。水稻生长旺盛时，内源GA3水平高，在进入成熟，走向衰老之前，内源GA3水平较低，用GA3处理能明显抑制乙烯的合成。生物体内的衰老和抗衰的机制是同时起作用，这是生物生存的基本机理，ABA和乙烯是促进衰老，而6BA+GA3是起到抗衰老的作用，所以在衰老过程中的激素间的调控是包含着激素间的平衡作用，外源6BA+GA3改善了激素间的平衡作用，使水稻在早衰过程中逆转。

（B）GA3的功能促进叶片面积扩大5—6平方厘米；6BA最明显的促进叶绿体的层状结构的发育，使质体数目明显增多，叶片厚度增加，叶绿素含量增多，同时叶片的脉络变得粗壮使叶片长势挺直向上，叶片的向光度增加，下部叶片的通风透光得到改善，有利叶片在流动的空气中捕获微量的二氧化碳，变成光合作用的原料，提高光合效率。有人作过计算，水稻的产量90%来自光合作用的产物，合理的水肥管理也只是改善水稻的光合机构，因而水稻的光能利用来增加产量是一切栽培育种的目标。

（C）6BA和PCPA的生理功能都具有刺激细胞分裂和组织分化，刺激子房膨大，促进坐果和果实膨大。6BA+PCPA产生的协同效应从宏观上看就是叶片的脉络变得粗壮，茎杆结实，籽粒的库容扩大，以试验品种汕优63为例，常规千粒重27—28克，而试验结果可达31.7克，净增3.17克；从这数字说明光合作用功能期延长，光合产物供应充实与叶片早衰产生的空秕粒形成鲜明对照。

（D）低节位分蘖在GA3的作用下拔长起来，主茎穗与分蘖穗高度相差不大，齐穗时间缩短两天；控制分蘖和促进分蘖都是一项增产措施，关键是水稻生育后期的生长势决定，而当今杂交水稻的弱势之一是“前期有余，后期不足”通过使用本产品能改善生育后期剑叶早衰的弱势；促使低节位的分蘖形

成有效穗，也是本产品增产的一个亮点。

（E）灌浆速度加快有利光合产物向籽粒方向转运。

娄成后院士在（植物生长调节剂发展前途的管见）一文指出：“植物生长发育的”“化学调控”是继“化学施肥”之后对提交大田生产的又一重大贡献”

参考文献

①娄成后（2001）学术报告“植物与环境和各部位信息的交换与物质的转移”

②陈虎保（2001）“中国植物生理学会. 植物生长物质委员会刊”

③张军（1999）中国植物生理学会植物生长物质应用研讨会论文集“基因表达的化学调控”

④季本华等（J）植物生理学1994 20（1）8-16

“低温强光胁迫下籼梗稲的光化学反应和膜脂过氧化表现”

⑤王叔华等（2002）中国植物生理学会，植物生长物质会刊“6BA对浮萍P143品系半叶状体光合作用的影响”

⑥赵毓桔“植物生理学报”1979 5（3）271-273